Latar Belakang: Mencuci tangan adalah teknik yang sangat mendasar dalam mencegah dan mengendalikan infeksi. Healthcare Associated Infections (HAIs) merupakan kejadian infeksi yang tidak hanya berasal dari rumah sakit, tetapi juga dapat dari fasilitas pelayanan kesehatan lainnya. Tidak terbatas infeksi kepada pasien namun dapat juga kepada petugas kesehatan dan pengunjung yang tertular pada saat berada di dalam lingkungan fasilitas pelayanan kesehatan. Karena hubungan yang konstan dengan pasien, perawat memainkan peran yang penting dalam pelaksanaan kebersihan tangan yang tepat diantara petugas klinis. Penyuluhan bertujuan untuk meningkatkan pengetahuan tenaga keperawatan sehingga diharapkan dapat mencegah HAIs, meningkatkan mutu pelayanan dan keselamatan pasien serta meningkatkan kompetensi tenaga keperawatan. Tujuan: Untuk mengetahui efektivitas penyuluhan cuci tangan dengan menggunakan media audiovisual terhadap tingkat pengetahuan mencuci tangan pada tenaga keperawatan di Rumah Sakit Universitas Tanjungpura Pontianak. Metode: Metode penelitian pre-eksperimen dengan rancangan one group pretest-postest. Jumlah sampel adalah 56 tenaga keperawatan. Analisis bivariat menggunakan Uji Wilcoxon. Hasil: Sebelum penyuluhan responden yang memiliki pengetahuan baik 8 orang, cukup 37 orang, kurang 11 orang. Setelah penyuluhan responden memiliki pengetahuan baik sebanyak 44 orang dan cukup 12 orang. Hasil uji Wilcoxon diperoleh nilai signifikan 0,00 (sig < 0,05). Dengan demikian terdapat efektivitas penyuluhan terhadap tingkat pengetahuan tentang cuci tangan sebelum dan sesudah penyuluhan. Kesimpulan: Penyuluhan menggunakan media audiovisual efektif dalam meningkatkan pengetahuan tenaga kesehatan Universitas Tanjungpura tentang cuci tangan.